基因編輯動(dòng)物凈化之——基因型鑒定

　　各位童鞋，考考你們基因工程小鼠成功繁育之后應(yīng)該做什么呢?

　　機(jī)智的你們一定能想到是基因型鑒定啦!

　　基因型鑒定在基因工程小鼠應(yīng)用中不可或缺，在很多同學(xué)眼里這可能是一項(xiàng)基礎(chǔ)性的工作，但實(shí)際上里面有N多小細(xì)節(jié)需要注意，下面就由小編帶你一起get小鼠基因型鑒定吧!

　　一、小鼠尾基因組DNA的制備

　　提到基因型鑒定，腦海中是不是閃現(xiàn)出“鼠尾DNA提取 PCR”的關(guān)鍵詞呢?

　　沒(méi)錯(cuò)，鼠尾基因組DNA的制備是基因型鑒定的第一步，也是整個(gè)實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要的步驟，其中有很多容易忽視的地方需要我們注意哦!

　　1. 樣本準(zhǔn)備

　　在基因型鑒定中，小鼠基因組DNA的制備是決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的關(guān)鍵。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般選擇在小鼠出生3-4周剪尾。

　　注意：① 鼠尾尾尖(<5mm)可獲得的DNA量足夠用于基因型鑒定。

　?、?剪鼠尾的剪刀每剪完一次需用酒精棉擦拭，避免DNA交叉污染。

　?、?避免鼠尾樣本帶有血液。

　　2. DNA抽提

　　1)將鼠尾剪碎，離心管中加入500uL裂解液和適量15 uL蛋白酶K(10 mg/mL)。

　　2)樣本浸于溶液中并充分振蕩混勻，置于55℃恒溫加熱儀。

　　3)加入500uL DNA提取飽和酚和500uL核酸提取液，12000 rpm離心10 min，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中。

　　4)上清中加入1mL無(wú)水乙醇(約2倍體積)，上下輕晃，直至出現(xiàn)絮凝的DNA沉淀，8000 rpm離心3 min，棄上清。

　　5)加75%的酒精1mL洗滌，12000 rpm離心5 min，棄上清，留沉淀，倒置干燥5 min。

　　6)加入200 µL DEPC水(可根據(jù)DNA量調(diào)節(jié))，使沉淀完全溶解，于-20℃保存?zhèn)溆?。DNA 樣品的 OD260/280 在 1.8-2.0 之間。

　　注意：① 需要充分裂解鼠尾，樣本應(yīng)消化至肉眼看不到大顆粒為止。

　?、?DNA模板濃度應(yīng)控制在50-100ng/ul進(jìn)行PCR。

　　二、PCR

　　成功的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不僅需要高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)濃度的DNA，根據(jù)產(chǎn)物GC的含量還需要選擇合適的PCR酶。在基因工程小鼠鑒定中，使用常規(guī)的PCR酶不一定能得到好的結(jié)果，往往需要用到特殊的PCR酶，一般在定制的基因工程小鼠鑒定方案中會(huì)指出適合的PCR酶。

　　讓我們一起看看基因工程小鼠的鑒定方案吧~

雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定方案
Primer	Sequence 5' --> 3'			Primer Type
oIMR1644	5'-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3'			Transgene
oIMR1645	5'-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3'			Transgene
42	CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT			Internal Positive Control Forward
43	GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC			Internal Positive Control Reverse
PCR Reaction System	Reaction Conponent			Volum（μL）
	10X Buffer			2.5
	ddH2O			16.75
	Primer			1
	Primer			1
	Mg2+			2
	dNTPs			0.5
	Taq			0.25
	Template			1
	Total			25
	phanta Max from Takara
Cycling Reaction	Step	Temp	Time	Cycle
	1	95	5min
	2	95	30sec
	3	60-65	30sec
	4	72	40sec	Goto step 2, 40 cycles
	5	72	5min
	6	10	Hold
Gentype	TG：608bp Control：324bp